化學(xué)發(fā)光基礎知識

一、什么是化學(xué)發(fā)光，與放免、酶免比較有何不同？

化學(xué)發(fā)光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是將化學(xué)發(fā)光與免疫反應相 結合，用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標記免疫測定技術(shù)。

化學(xué)發(fā)光免疫分析比放射免疫，酶聯(lián)免疫具有更高靈敏度，具備操作簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)， 易于標準化操作。且測試中不使用有害的試劑，試劑保存期長(cháng)，應用于生物學(xué)、醫學(xué)研究和臨床 實(shí)驗診斷工作，成為非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。

(1) 與放免（RIA)產(chǎn)品比較

與放射免疫試劑（RIA)比較，化學(xué)發(fā)光避免了放射性核素的污染以及對操作人員的傷害， 大大縮短了反應時(shí)間，同時(shí)兼具高靈敏度的優(yōu)勢。

(2) 與酶免（ELISA)產(chǎn)品比較

靈敏度與可測范圍遠遠高于酶免產(chǎn)品，兼具ELISA法簡(jiǎn)便的操作方法與較短的反應時(shí)間。

二、什么是標記免疫技術(shù)，它的三大要素是什么？

將Ag或Ab用標記物(如熒光素、酶、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等)進(jìn)行標記，在與標本 中的相應Ab或Ag反應后，可以不必測定Ag-Ab復合物本身，而測定復合物中的標記物，通過(guò)標 記物的放大作用，進(jìn)一步提高了免疫技術(shù)的敏感性。

三要素：通常在檢測系統中會(huì )使用到一種叫標記物（labeling)的物質(zhì)，常標記在抗體上 通常會(huì )有一個(gè)分離（separation)的過(guò)程在最后讀取信號前 需要去仔細關(guān)注一下分析的模式（format)

三、標記免疫技術(shù)主要有哪幾種？

主要經(jīng)歷了四種標記免疫技術(shù)的發(fā)展：

熒光素(Fluorophores) - FIA

放射性同位素(Radioisotopes) - RIA

酶（Enzymes) - EIA

化學(xué)發(fā)光物質(zhì)-CLIA

四、化學(xué)發(fā)光原理？ 分析方法及過(guò)程

釆用微孔板作為固相載體，以魯米諾作為發(fā)光劑，固相載體的應用擴大了測定的范圍。以競爭法、夾心法等免疫測定方法為基礎。每個(gè)試劑盒都包含標準品、酶結合物、底物、洗液、包被板，降低了試劑成本，減少了交叉污染，保證了檢測質(zhì)量。

⑴、抗原抗體結合：將待測標本加入包被單克隆抗體的微孔板中，標本中的抗原與微孔板的抗體結合，再加入辣根過(guò)氧化物酶標記的抗體，經(jīng)溫育后形成固相包被抗體-抗原-酶標記抗體復合物。

⑵、洗滌、分離：經(jīng)過(guò)5次洗滌，很快將未結合的多余抗原和酶標記抗體洗去。

⑶、加入底物luminol發(fā)光劑：luminol被結合在微孔板的辣根過(guò)氧化物酶的催化下可以催化經(jīng)過(guò)過(guò)氧化氫的分解，使過(guò)氧化氫變成水和單氧，其中單氧可氧化魯米諾，魯米諾經(jīng)氧化后可發(fā)出藍光。這種化學(xué)發(fā)光持續時(shí)間長(cháng)，可達數小時(shí)之久。通過(guò)光量子閱讀系統記錄發(fā)光強度，并從標準曲線(xiàn)上計算出待測抗原的濃度。

五、什么是鉤狀效應（hook effect)，如何判斷及解決？

免疫測定的實(shí)質(zhì)是抗原抗體反應，抗原抗體反應是按?定的分子比例結合，當二者比例適中 時(shí)，形成的免疫反應最強烈，形成復合物或檢測的信號與所測的抗原或抗體成比例關(guān)系，但當抗 原或抗體其中一者過(guò)量時(shí)，免疫反應將減弱，測定值呈現假性低值。

在化學(xué)發(fā)光中像二步分析法…般都能避免鉤狀效應，對于一步夾心法項目說(shuō)明書(shū)中都提到了 產(chǎn)生鉤狀效應的上限如人絨毛膜促性腺激素的鉤狀效應值是100萬(wàn)在實(shí)際工作中如遇到 測定值與臨床嚴重不符的結果要考慮到鉤狀效應，解決辦法是稀釋此樣本。

六、什么是嗜異性抗體？

病人樣品中可能自然產(chǎn)生一些針對動(dòng)物免疫球蛋白的抗體(通常是鼠或羊)，-般來(lái)源于暴露于這些動(dòng)物或接受過(guò)動(dòng)物血清的治療，分析的干擾：可以在雙單克隆夾心法分析模式中引起假陽(yáng)性，可以在單克隆/多克隆分析模式中出現假陰性。

廠(chǎng)家在試劑生產(chǎn)中會(huì )加入封閉劑，封閉劑可以加在反應基質(zhì)中或整合在試劑盒內：鼠（鼠科 類(lèi))，鳥(niǎo)（鳥(niǎo)科類(lèi)）和羊蛋白，各個(gè)廠(chǎng)家生產(chǎn)的分析試劑都有可能會(huì )不同程度的受到任何一個(gè)病人血清的影響！當遇到與臨床不符的結果時(shí)要詢(xún)問(wèn)病史看是否有嗜異性抗體的干擾。

七、什么是基質(zhì)效應？

基質(zhì)是指的是樣品中被分析物以外的組分?；|(zhì)常常對分析物的分析過(guò)程有顯著(zhù)的干擾，并影響分析結果的準確性。目前最常用的去除基質(zhì)效應的方法是，通過(guò)已知分 析物濃度的標準樣品，同時(shí)盡可能保持樣品中基質(zhì)不變，建立一個(gè)校正曲線(xiàn)（calibration curve)。

八、稀釋樣品時(shí)稀釋物不對為何有基質(zhì)效應？

我們在稀釋樣品時(shí)要考慮到基質(zhì)效應的影響，稀釋必須在適當的基質(zhì)中進(jìn)行，對于 大多數測定而言，適當的基質(zhì)就是零校準品，如果分析物稀釋基質(zhì)效應中所含成分濃度不正 確，稀釋回收率就不能對它們進(jìn)行準確的測定，因為它們稀釋后會(huì )與Bing agent形成新的平衡。

九、如何看待說(shuō)明書(shū)中的方法局限性？

此章節的內容極為重要，實(shí)驗室工作人員必須對其進(jìn)行理解，因為它關(guān)系到實(shí)驗室能否對 樣本分析結果進(jìn)行正確的解釋。在解釋結果時(shí)，需參照該病人的整體臨床情況，包括：癥狀、 臨床病史以及其它測試所得的數據和其它相應的信息。

十、如何理解最高可報告值？

當樣品濃度高時(shí)，可以報告大于最高校準品值的結果，有些試劑生產(chǎn)商的的測定系統通常 用亮點(diǎn)調整來(lái)代替完全校準，這樣的話(huà)他們可報告范圍是一個(gè)擬合而出的最高水平（而非 實(shí)際測定值)。而在ACCESS檢測系統中，用戶(hù)自己創(chuàng )建了標準曲線(xiàn)，當該標準曲線(xiàn)意境通 過(guò)并且質(zhì)控檢測被接受時(shí)，就可以證實(shí)其可報告的上限。當樣本分析所得的RLU值高于最 高校準品時(shí)，以樣本結果大于最高校準品值的形式報告，多數實(shí)驗室對大多數測定項目的 分析結果使用這種直接報告模式，如果需要獲得確切的測定值，則需要進(jìn)行機外人工稀釋 并重新分析樣本。

十一、如何理解最低可報告值？

所有的定景測定在曲線(xiàn)的下端通常都有一個(gè)零標準，該標準允許計算結果低至零，當測定 結果越接近零時(shí)，測定結果就越不那么精確。在說(shuō)明書(shū)中給出了項目的檢測最低下限，建 議以低于該下限來(lái)報告結果。

十二、什么是分析靈敏度？

分析零敏度通常是對標準曲線(xiàn)上的零點(diǎn)校準品距零值的2SD值范圍來(lái)進(jìn)行測定計算的（而 SD值是將零校準品作為未知濃度樣品經(jīng)多管檢測后計算均值所得）

十三、什么是功能靈敏度？

功能靈敏度(Functional sensitivity)為<20%CV時(shí)所能檢測到的最低極限濃度，它反映在實(shí)際樣品檢測時(shí)所能達到精確定量的檢測極限。

十四、如何理解說(shuō)明書(shū)中的稀釋回收率？

稀釋回收率與稀釋線(xiàn)性不不完全是一回事，但是二者可用同一個(gè)研究方式來(lái)檢驗，要進(jìn)行 稀釋回收率測定首先用戶(hù)需要選取…個(gè)已知濃度的病人樣本，在分析項目的線(xiàn)性范圍內對 其進(jìn)行多點(diǎn)稀釋后進(jìn)行檢測，如果所測得結果與最初的樣本稀釋系數結果相匹配，那么就 驗證了稀釋回收率與檢測線(xiàn)性范圍。稀釋線(xiàn)性與回收率的區別在于，將一組分析物校準品 當未知樣品進(jìn)行分析，來(lái)對其檢測線(xiàn)性范圍進(jìn)行驗證。

十五、定標液為凍干粉的些注意事項？

如 T3、T4、FT3、FT4、TSH等

凍干粉定標液復溶：復溶水的水質(zhì)加樣容器的準確度加樣的技術(shù)混勻/旋轉

復溶后定標液保存：使用合適的冷凍保存試管正確標簽無(wú)霜冰箱保存

十六、化學(xué)發(fā)光項目是否可以使用血漿等其他樣本類(lèi)型，有無(wú)影響？

并不是所有的免疫項目都可以使用血漿，具體請參閱項目說(shuō)明書(shū)，但為了避免不同項目樣本類(lèi)型的差異，同時(shí)保證同一患者使用同樣的樣本類(lèi)型，因此我們推薦統一使用血清樣本。

十七、樣本溶血、脂血對化學(xué)發(fā)光結果項目有影響嗎？

樣本溶血、脂血、黃疸對化學(xué)發(fā)光項目同樣是有影響的，不過(guò)影響機制與影響比色等 項S不同。如溶血對胰島素影響是因為樣本溶血后紅細胞釋放種胰島素滅活酶而使樣 本中胰島素濃度減少。不同項目對樣本禁忌要求不同，具體請査閱“化學(xué)發(fā)光項目速査 樣本禁忌內容”。

十八、樣本分析前處理都應該注意什么？

有以下幾點(diǎn)需特別注意：

一、采血管質(zhì)量，有無(wú)失效，添加劑是否適當，釆血員專(zhuān)業(yè)水平

二、釆血量是否適當，是否及時(shí)進(jìn)行混勻，血漿應該8-10次，血清應該5次。

三、血清凝固時(shí)間是否充足，離心是否徹底，離心機是否定期校正。

四、貯存條件是否適當。

十九、什么是分析靈敏度和功能靈敏度？

最低檢測濃度/極限(Minimal detectable concentration/limit, MDC/MDL)是反映最低可 區別于

零值的濃度，又稱(chēng)分析靈敏度(Analytical sensitivity)。功能靈敏度(Functional sensitivity)

為<20%CV時(shí)所能檢測到的最低極限濃度，它反映在實(shí)際樣品檢測時(shí)所能達到 精確定暈的檢測極限。

二十、切點(diǎn)(Cut-off)的概念是什么？

最理想的切點(diǎn)是能將二個(gè)不同人群完全分開(kāi)，例如疾病人群和正常人群。而實(shí)際狀況是人群之間會(huì )有一個(gè)交叉，所以切點(diǎn)就只能在臨床靈敏度和特異性之間尋找一個(gè)相對的平衡點(diǎn)，也就是說(shuō)需符合臨床的大多數的需求。